NMR

Die kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) wird als Standard-Analysemethode zur Strukturbestimmung von organischen Verbindungen verwendet. Bei der NMR-Analyse entspricht das Verhältnis der Anzahl der Atomkerne in einer Verbindung dem Verhältnis der Flächen der Peaks im Spektrum.

Eine Probe und ein Standard (ein interner Standard) mit bekannter Reinheit werden miteinander vermischt und in einem deuterierten Lösungsmittel gelöst. Ein quantitativer Wert für die Reinheit der Probe kann aus dem Verhältnis zwischen der Oberfläche der von der Probe und dem Standard stammenden spektralen Peak, der Anzahl der Protonen, den Massen und den Molekulargewichten von Probe und Standard berechnet werden.

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NMR-Standards

Merck Supelco bietet eine Reihe von auf NIST SRM rückverfolgbaren zertifizierten Referenzmaterialien zur Verwendung als interne Standards in quantitativen NMR-Studien an. Das Angebot umfasst qNMR-Standards für NMR-Experimente mit 1H, 31P und 19F.

Häufig gestellte Fragen

Die kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) ist eine spektroskopische Technik, mit der strukturelle und dynamische Eigenschaften von Molekülen durch Ausnutzung des Verhaltens bestimmter Atome in sehr starken supraleitenden Magneten (180.000 bis 360.000 Mal stärker als das Erdmagnetfeld für Magnete bei UConn Health) ermittelt werden können. Wenn NMR-aktive Nuklei in ein starkes Magnetfeld gebracht werden, richten sich ihre Nuklei an dem Feld aus und nehmen eine Frequenz an, die vom gyromagnetischen Verhältnis der Isotope und der Stärke des angelegten Magnetfeldes sowie von der chemischen und physikalischen Umgebung des Atoms abhängt. Die Komponente der Frequenz, die von der chemischen und physikalischen Umgebung abhängig ist, wird als chemische Verschiebung bezeichnet. NMR-Experimente stören die Ausrichtung, indem sie die chemische Verschiebung jedes der NMR-aktiven Atome im untersuchten Molekül mithilfe kurzer Impulse von Radiofrequenz-Energie (RF) bestimmen. Durch den Einsatz von Kombinationen aus Impulsen und Verzögerungen (Impulsfolge genannt) können zusätzliche Informationen ermittelt werden, z. B. welche Atome aneinander gebunden sind und welche Atome räumlich nahe beieinander liegen. Dank der Durchführung vieler verschiedener Experimente ist es möglich, die dreidimensionale Struktur von Molekülen zu bestimmen, einschließlich großer Biomoleküle wie Proteine.

Hochauflösende NMR-Untersuchungen sind eher für Proteine mit einer Masse von weniger als etwa 25 kDa und einer Löslichkeit bis etwa 0,5 mM möglich. In einigen Fällen kann es möglich sein, Proteine oder Komplexe von größerer Größe oder geringerer Löslichkeit zu untersuchen. Membranproteine lassen sich nur schwer mit hochauflösenden Methoden untersuchen, doch heute gibt es neue Techniken, die möglicherweise auf sie anwendbar sind. Da NMR-Studien normalerweise eine Markierung erfordern, muss das Protein mit den stabilen Isotopen 15N, 13C und manchmal 2H (ein Expressionssystem, das für das Wachstum in markierten Medien geeignet ist) verfügbar sein. Die Proteine müssen gereinigt (typischerweise sind >95 % erforderlich), gefaltet und zumindest geringfügig stabil sein. Eine vorläufige Charakterisierung durch Zirkulardichroismus und thermische oder Lösungsmittel-Denaturierung wird empfohlen.

Diese Frage ist schwer zu beantworten, da sie von den zu untersuchenden Fragen und dem Verhalten der Probe abhängt. Typischerweise werden 300 µl (mit speziellen NMR-Röhrchen) bis 600 µl der Probe benötigt. Die Proteinkonzentrationen sollten für gut funktionierende Systeme in Strukturstudien über 150 µM liegen, für andere, nicht strukturelle Studien können jedoch niedrigere Konzentrationen verwendet werden. Obwohl grob geschätzt 150 µM als niedrigste Konzentration für Strukturstudien verwendet werden kann, ist es ratsam, die Proteinkonzentrationen so hoch wie möglich anzusetzen. Außerdem sollten die Konzentrationen durch die Löslichkeit und das Verhalten des Proteins begrenzt werden, nicht durch die Menge des vorbereiteten Proteins. Der Zeitaufwand für die Durchführung längerer Experimente zur Kompensation niedriger Konzentrationen und die längere Zeitspanne zur Interpretation von NMR-Spektren wird mit ziemlicher Sicherheit länger sein als die Zeit, die für die Vorbereitung einer zusätzlichen Probe benötigt wird.

Nachdem die Probe ausreichend gereinigt und getrocknet wurde, besteht der nächste Schritt darin, ein geeignetes Lösungsmittel zu wählen. Da Deuterium der bei weitem beliebteste Nukleus zum Aufschließen ist, wird die Probe normalerweise in einem deuterierten Lösungsmittel gelöst (ein deuteriertes Lösungsmittel ist ein Lösungsmittel, in dem ein großer Anteil, typischerweise mehr als 99 %, der Wasserstoffatome durch Deuterium ersetzt wurden). Häufig verwendete deuterierte Lösungsmittel sind Aceton-d6, Benzol-d6 und Chloroform-d, wobei auch viele weitere Lösungsmittel verfügbar sind.

Bei der Auswahl eines Lösungsmittels sind folgende Faktoren zu berücksichtigen:

1. Löslichkeit:

  • Dabei gilt: Je löslicher die Probe ist, desto besser ist sie. Dadurch wird die Menge der Probe innerhalb des empfindlichen Volumens maximiert, was die Empfindlichkeit des Experiments erhöht. Eine hohe Löslichkeit ist besonders wichtig, wenn nur geringe Mengen der Probe zur Verfügung stehen.

2. Interferenz von Lösungsmittelsignalen mit dem Probenspektrum

  • Das Lösungsmittel selbst erzeugt unweigerlich NMR-Signale, die Bereiche des Spektrums überlagern. Diese „Restlösungsmittel-Peaks“ sollten die Signale aus der Probe nicht überlagern.

3. Temperaturabhängigkeit:

  • Für Experimente über oder unter Raumtemperatur sind auch die Schmelz- und Siedepunkte der Lösungsmittel entscheidende Faktoren. Außerdem variiert die Löslichkeit der Probe wahrscheinlich mit der Temperatur.

4. Viskosität:

  • Je niedriger die Viskosität des Lösungsmittels, desto besser die Auflösung des Experiments.

5. Kosten:

  • Bei der Routine-NMR, bei der viele Proben gemessen werden müssen, sind die Kosten für Lösungsmittel ein wichtiger Faktor. Als Faustregel gilt, dass der Preis mit der Anzahl der deuterierten Atome steigt.

6. Wassergehalt:

  • Fast alle NMR-Lösungsmittel enthalten Spuren von Wasser. Außerdem sind viele von ihnen hygroskopisch (sie nehmen Wasser aus der Atmosphäre auf) und enthalten daher umso mehr Wasser, je länger sie gelagert werden. Das Vorhandensein eines Wasser-Peaks (HDO) führt zu einer Qualitätsminderung der NMR-Spektren. Der Wassergehalt im Lösungsmittel kann durch Filtration durch ein Trockenmittel oder durch Lagerung des Lösungsmittels über einem Molekularsieb stark reduziert werden.
  • Bei der Wahl des Lösungsmittels für eine bestimmte Probe sollte der bestmögliche Kompromiss zwischen den verschiedenen Vor- und Nachteilen eingegangen werden. Genaue Angaben zu spezifischen Lösungsmitteln finden Sie im Text zur Standard-NMR.